激光共聚焦顯微鏡可以觀察到細胞內(nèi)已經(jīng)標記好的蛋白質(zhì)和分子，為生物學研究提供了更直觀的觀測方法新技術。如今共同學習，激光共聚焦成像已經(jīng)是一個非常常規(guī)的實驗操作，廣泛應(yīng)用于生物學各個研究領(lǐng)域中聽得懂。
在細胞實驗中應用優勢，如果要進行一次激光共聚焦成像，除了要知道相關(guān)的顯微鏡參數(shù)設(shè)置和操作以外全方位，樣品的準備也是非常重要的一個環(huán)節(jié)高效節能。
由于激光共聚焦實驗對觀測耗材的底部有著比較高的要求，普通的培養(yǎng)皿大局，培養(yǎng)板或者培養(yǎng)瓶都不能直接用于激光共聚焦成像新創新即將到來。
1.比較常用的是使用170μm左右厚度的蓋玻片作為激光共聚焦成像的細胞載體。但是使用蓋玻片有序推進，在實驗操作上是非常麻煩的，如果買的是國產(chǎn)的蓋玻片，首先要做的一步是將蓋玻片清洗并且烘干滅菌強大的功能，才能開始使用結論。
2.進口的細胞爬片，雖然不需要清洗迎難而上，但是還是需要進行包被才能讓細胞正常貼壁生長積極。通常是將處理好爬片直接放在多孔板中，然后鋪細胞堅持先行，熒光染色后產業，再用鑷子將爬片拿出，反過來放在滴有封片劑（甘油配置）的載玻片上情況較常見，再進行成像可持續。如圖1所示：
圖1：使用蓋玻片和細胞爬片的做免疫熒光方法示意圖
操作流程：
1.蓋玻片需用濃硫酸浸泡過夜，第二天用自來水沖洗20遍體製，置于無水乙醇中6小時服務，后用三蒸水沖洗3遍，再放在飯盒或玻璃培養(yǎng)皿中烘干能力和水平，消毒大型，再烘干后放入超凈臺備用。
2.準備好的蓋玻片或者專業(yè)的細胞爬片需要根據(jù)細胞的貼壁情況使用多聚賴氨酸等蛋白包被明確相關要求。
3.培養(yǎng)板中放置爬片非常有技巧重要意義，要將爬片與培養(yǎng)板底部緊密貼合，這樣才能避免長成雙層細胞深化涉外。
4.常規(guī)免疫熒光操作后體系，取出爬片。準備載玻片一張開展試點，在中間滴加適量的封片劑（甘油配置）攜手共進，將蓋玻片或爬片翻過來，蓋在封片劑上推進一步，再用指甲油封片進行成像經過。
5.在激光共聚焦成像之前簡單化，盡量用熒光顯微鏡檢查一下細胞狀態(tài)和成像效果，再去做激光共聚焦明確了方向，畢竟做一次激光共聚焦的成像也不便宜的系統性。
ibidi無需爬片的簡便方法
這里要介紹ibidi的簡便方法，大大簡化了樣品準備流程單產提升，需要用到專為共聚焦實驗設(shè)計的共聚焦培養(yǎng)皿傳遞，這里以德國ibidi的共聚焦培養(yǎng)皿為例（ibidi 81156，ibiTreat底部處理）進行說明勞動精神。共聚焦培養(yǎng)皿的底部是polymer聚合物材質(zhì)開展攻關合作，具有親水表面，讓大多數(shù)種類的細胞都可以直接貼壁預下達，無需另外進行包被的有效手段；同時，它們的底部符合蓋玻片標準——厚度僅為180μm方案，在折射率應用情況，阿貝系數(shù)上，它們的性能和標準爬片一致組建，再加上極低的自發(fā)熒光和細胞可以直接貼壁的特性表現，使它們成為共聚焦成像的專用培養(yǎng)皿。
所有的操作都在培養(yǎng)皿中進行首次，不再需要鑷子以及繁瑣的清洗可能性更大，滅菌，包被程序（流程如圖2所示）
圖2：共聚焦專用培養(yǎng)皿的準備樣品流程搖籃，可以直接進行細胞培養(yǎng)－染色－成像操作（圖中使用的產(chǎn)品為ibidi 81156共聚焦培養(yǎng)皿）
操作流程：
1.在超凈臺中打開無菌包裝的共聚焦專用培養(yǎng)皿技術，取出培養(yǎng)皿，加入細胞懸液推動，蓋上皿蓋相對較高，放入培養(yǎng)箱中靜置，等待細胞貼壁信息。常規(guī)細胞培養(yǎng)相關，待細胞長置合適密度再取出，進行免疫熒光染色豐富內涵。
2.吸出培養(yǎng)基生產效率，以PBS清洗細胞，再用2%的多聚甲醛PBS溶液固定細胞適應性。
3.20分鐘后節點，吸出固定液，加入0.1%Triton X-100
4.10分鐘后落地生根，吸出Triton的特點，清洗細胞后加入BSA封閉健康發展。
5.加入抗體熒光染色后，吸出所有試劑大數據，加入封片劑長效機製，可以開始共聚焦顯微成像。
使用共聚焦培養(yǎng)皿還有個好處：往往一個共聚焦掃描成像持續(xù)時間很長高效化，培養(yǎng)皿中的液體非常容易揮發(fā)製高點項目，共聚焦培養(yǎng)皿有皿蓋為產業發展，可以減少揮發(fā)範圍和領域；如上述提到的ibidi共聚焦培養(yǎng)皿，有個巧妙的鎖扣設(shè)計各項要求，可以扣緊培養(yǎng)皿更高要求，確保在共聚焦成像的過程中，皿中的液體不會揮發(fā)(如圖3）新技術。
圖3：ibidi共聚焦培養(yǎng)皿的鎖扣設(shè)計
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